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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷硝化作用修饰语组学、LC-MS/MS磷硝化作用位点介绍技术服务。
英语宝贝标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
汉语标题格式：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
消费者方：山东大学
设计食材：拟南芥侧根
拜谱出具技术应用：磷碱化遮盖组学、LC-MS/MS磷碱化位点探讨
研究方案构思：
PART 01 探析的结果
01、植物的生长素增进VIK的磷硝化作用下列不属于转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷酸性反应核核苷酸酚类化合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 种植素提高网站VIK的磷碱化及转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷酸性反应进行实验。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酒曲双混种剖析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶专一性成相实验英文（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体外磷硝化作用实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。时实参考值PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素讯号良好改善 LR 成长
进行数据分析好几个VIK T-DNA进到这一领域突然变化体（vik-2和vik-3），得知与天然的型优于，突然变化体的LR规格单位、LR原基（LRP）和已健康成长的LR明显才能减少，还是比较是vik-2（图2）。反而，过显示VIK的转基因植物遗传植物组茎叶主要表现出LR规格单位添加。不但，在vik-2突然变化体情况下显示VIK的转基因植物遗传植物组茎叶恢复正常了LR健康成长缺欠。生長素解决實驗显示，vik-2突然变化体对生長素促进的LR健康成长做用降低，显示VIK在生長素干预LR健康成长中起着的关键做用。 
图2 VIK介导的的生长素手机信号径路同向调整LR的生长
03、VIK 与ERF13 完成生物学数据交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子荧光相容 （BiFC）和免疫细胞共沉淀出的检测（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13主动能力
04、VIK以正反两面馈的的方法政策调控ERF13磷硝化作用
通过磷碱化蛋清组学概述，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点基因变异得知显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反两面馈形式磷过酸ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷碱化使得ERF13光降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体之外检测英文和自身检测英文，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模以和磷酸降解变异体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚细胞膜准确定位分享表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷酸性反应高速度了ERF13可降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷过酸调接 LR 的显现
研究方案进那步讨论了VIK政策调控的ERF13分解在侧根（LR）发育状况中的功用。确认比区别转基因食品组沉水值物系的LR表型，看到过表答方式ERF13促使了LR的现身，在vik突变的体中这个促使功用减小，而在过表答方式YFP-VIK的背景图下这个促使功用减小（图6）。除此之外，比ERF13的区别磷碱化仿真模拟仿真和磷酸灭活变种体的过表答方式沉水值物系，看到ERF132A-Myc（磷酸灭活）的沉水值物系LR现身更小，而ERF132D-Myc（磷碱化仿真模拟仿真）的沉水值物系LR现身略多。这个结杲揭示，VIK介导的ERF13磷碱化和分解提高网站了LR的现身。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸增进LR的存在
07、VIK在侧根阴茎发育中磷硝化作用并安全LBD18淀粉酶
采用解析几个VIK T-DNA导入变化体（vik-2和vik-3），遇到与野山型不同之处，变化体的侧根（LR）溶解度、LR原基（LRP）和已成长健康骨骼阴茎发育的LR不错提高，越发是vik-2（图7）。不同，过表答VIK的转表观遗传茎叶特征出LR溶解度增强。凡此种种，在vik-2变化体视频背景下表答VIK的转表观遗传茎叶找回了LR成长健康骨骼阴茎发育缺欠。生長素进行处理实验设计表达，vik-2变化体对生長素促进的LR成长健康骨骼阴茎发育表现减少，表达VIK在生長素调空LR成长健康骨骼阴茎发育中引领重要性用途。 
图7 VIK 在LR产生时中间接磷酸性反应和可靠LBD18核蛋白
PART 02 内容个人总结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷酸性反应蛋白酶质组学分析一下筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的萌发素移动信号调侧根导致
PART 03 拜谱个人心得体会
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的核蛋白酶质组学、表达核蛋白酶质组学、分解组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—高的深度DIA·磷硝化作用淡化组，采用创新生物富集水平+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现爬行动物范本10w+、绿色植物范本5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
规范学术论文：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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